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细菌溶血素毒性和致病机制研究现状分析

作者: amvip
来源: uumtu
日期: 2018-11-19 17:58
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许多细菌能产生一种或多种溶血素 (hemolysin) [1]。以往认为细菌溶血素溶解红细胞与否可作为细菌表型鉴定指标, 但对其致病作用所知甚少。近年研究发现, 细菌溶血素还能损伤甚至致死多种有核细胞和血小板, 如单核细胞、粒细胞、肥大细胞、成纤维细胞、心肌细胞和内皮细胞等, 故又称为细胞溶素 (cytolysin) , 从而参与细菌致病过程中发挥了重要作用。本文就细菌溶血素分类及其功能、膜损伤和致病机制等方面进行综述。
  
  1 溶血素分类与功能
  
  早年细菌溶血素多根据抗原性差异分类。例如, 金黄色葡萄球菌溶血素因抗原性不同分为α、β、γ、δ、ε五型, 其中以α-溶血素致病作用最强。近年发现细菌溶血素还可损伤或溶解其他细胞, 故溶血素通常以菌名加溶素 (-lysin) 命名。例如, 链球菌溶素O (Streptolysin O, SLO) 、李斯特菌溶素O (Listeriolysin O, LLO) 、肺炎链球菌溶素 (Pneumolysin, PLY) 、产气荚膜梭菌溶素O (perfringolysin O, PFO) 等。根据分子结构、结合细胞方式、膜孔道形成机制和靶细胞反应的不同, 可将细菌溶血素分为重复子毒素家族 (repeats in toxin family, RTX) 、胆固醇依赖细胞溶素家族 (cholesterol-dependent cytolysin family, CDC) , 但金黄色葡萄球菌α-溶血素既不属于RTX, 也不属于CDC。
  
  1.1 RTX家族
  
  目前其成员超过1 000种, 多由革兰阴性菌产生[2]。PTX结构独特, 其肽链C端结构域中有数量不等、富含甘氨酸且包含天冬氨酸的9肽重复序列, 即G-G-X-G- (N/D) -D-X- (L/I/F) -X, 该家族也由此命名[3]。RTX与Ca结合后才表现出毒性, 9肽重复序列为Ca结合区, 此结合过程在菌体外完成, 然后才能与细胞受体结合并发挥毒性作用。
  RTX可插入靶细胞膜中形成分子量100~200 k Da的多聚体通道, 使胞内物外溢并引发溶血或溶细胞效应[2-4]。大肠埃希菌α溶血素Hly A是RTX家族典型代表, 其分子量107 k Da, 有13个RTX重复序列, 合成后Hly A无活性, 在?;泼窰ly C作用下, Hly A中两个赖氨酸脂肪?;? 成为成熟分子并获得膜孔道形成活性[5]。RTX家族其他成员有30%~75%序列与大肠埃希菌Hly A相同, 其成熟和活化也依赖于氨基酸?;奘蝃4,5]。
  RTX通过细菌I型分泌系统 (type 1 secretion system, T1SS) 分泌, T1SS由位于内膜的ATP结合装置 (ABC) 、位于周浆间隙的膜蛋白复合物形成蛋白 (MFP) 和一个跨越外膜的外膜蛋白 (OMP) 组成, 由rtx-操纵子基因编码[6]。RTX的C端有输出信号结构域 (domain) , 可与T1SS结合后转运至胞外[3,6]。
  目前发现, 细菌接触细胞后RTX才发挥毒性作用[7]。例如, 大肠埃希菌Hly A对靶细胞攻膜过程如下: (1) 静电力敏感可逆吸附和不可逆插入:迄今未发现Hly A受体, 插入能力与分子变构有关, 不依赖胆固醇; (2) 跨膜通道形成:Hly A单分子插入膜中, 然后在膜内形成同源低聚体, 1~3个Hly A即可形成跨膜孔道[5,7]。靶细胞膜上RTX积聚及持续作用可导致细胞凋亡[7]。
  
  1.2 CDC家族
  
  CDC通过靶细胞膜上胆固醇发挥作用, 多由革兰阳性菌产生[8,9]。常见的CDC有链球菌溶素SLO、李斯特菌溶素LLO、肺炎球菌溶素PLY和产气荚膜梭菌溶素PFO[9]。
  CDC可在靶细胞膜上形成大型跨膜孔道, 其过程如下: (1) CDC单体被靶细胞表面胆固醇受体识别并结合; (2) 30~50个单体分子聚合后形成环状孔道前体复合物; (3) 复合物变构后插入细胞膜中形成大型β-桶状跨膜孔道[8]。例如, SLO与靶细胞膜胆固醇受体结合后, 单体分子发生寡聚化, 形成环状前孔结构 (pre-pore structure) , 继而变构插入细胞膜中形成大型跨膜两亲性桶状孔道[10]。目前发现SLO形成的孔道最大, 其直径30~35 nm, 可使细菌毒力因子进入细胞或细胞蛋白外溢。此外, CDC还可诱导炎症反应[11]。
  
  1.3 其他
  
  金黄色葡萄球菌α-溶血素Hla不属于RTX和CDC家族成员。Hla由292个氨基酸组成, 可损伤红细胞和血小板, 引起小血管平滑肌收缩甚至痉挛, 导致局部缺血坏死, 也可引起单核细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞损伤。Hla损伤靶细胞膜过程如下: (1) 通过非特异性高亲和力受体与膜表面非特异性底物磷脂酰肌醇或胆固醇初步结合于靶细胞膜; (2) 与特异性受体解整合素样金属蛋白酶ADAM10结合并集中于小窝蛋白-1 (caveolin-1) 富集区; (3) 7个单体与细胞膜磷脂分子中强亲水性磷酸基团反应后形成七聚体, 其下端为14个β-折叠反向平行排列而成的花篮状穿孔结构; (4) 七聚体转变为桶状结构, 形成直径为l~1.5 nm穿膜孔道; (5) 孔道较小但可使ATP和铁离子等胞内小分子物质漏出, 同时不可逆地改变细胞渗透压和膜完整性, 导致溶血和有核细胞肿胀及死亡, ADAM10与Hla结合后酶活性增强, 可裂解E-钙粘蛋白导致细胞屏障破坏甚至死亡[12,13]。
  
  2 溶血素的细胞毒性与膜损伤机制
  
  根据细菌溶血素对靶细胞的毒性与膜损伤机制不同, 可分为膜成孔毒素、酯酶毒素和表面活性毒素。此外, 线粒体和溶酶体膜也可成为一些细菌溶血素作用靶点。
  
  2.1 膜成孔毒素 (pore-forming toxin, PFT)
  
  PFTs能在靶细胞膜上形成穿膜孔道, 破坏细胞膜结构并使其渗透性增强而导致细胞渗透性溶解。根据二级结构不同, PFT分为α-PFT和β-PFT, 分别形成α-螺旋两亲性跨膜孔道和β-桶状跨膜结构[8]。例如, 金黄色葡萄球菌α-溶血素、P-V杀白细胞素形成直径小于2.5 nm的跨膜小孔道, CDC家族蛋白则形成直径30nm及以上的跨膜β-桶状大孔道。
  不同物种或不同细胞对同一PFT敏感性有差异[14-15]。例如, 金黄色葡萄球菌α-溶血素溶解兔红细胞能力强于羊红细胞, 不能溶解人红细胞, 但能溶解人血小板、血管内皮细胞、上皮细胞和白细胞, 溶解人淋巴细胞、单核细胞的浓度仅为溶解粒细胞的1/100[14]。此外, ADAM10表达量与细胞对金黄色葡萄球菌α-溶血素敏感性相关, 人肺上皮A549细胞ADAM10被敲低后, 对金黄色葡萄球菌α-溶血素的抵抗力显著增强[12]。
  
  2.2 酯酶类毒素 (lipasic toxin, LPT)
  
  LPT水解靶细胞膜磷脂, 导致膜损伤甚至细胞裂解。例如, 铜绿假单胞菌溶素具有水解卵磷脂的磷脂酶C (phospholipase C, PLC) 活性, 金黄色葡萄球菌β-溶血素具有PLC和水解鞘磷脂的鞘磷脂酶 (sphingomyelinase, SMse) 活性[16]。金黄色葡萄球菌β-溶血素为Mg依赖单链酯酶类毒素, 同时具有PLC和SMse活性, 水解卵磷脂后产生磷脂?;藕投8视? 水解鞘磷脂后可产生神经酰胺, 损伤细胞膜或导致细胞渗漏而裂解。
  不同物种或不同细胞的细胞膜对同一LPT敏感性有差异[16]。例如, 金黄色葡萄球菌β溶血素迅速溶解绵羊红细胞, 但溶解兔红细胞的速度较慢, 可使白细胞和淋巴细胞活力显著降低但不裂解。
  
  2.3 表面活性类毒素 (surface active toxin, SAT)
  
  SAT是一种两性分子, 但疏水性相对较强, 可插入细胞膜引起膜表面张力和渗透压改变, 损伤细胞膜甚至导致细胞裂解。
  金黄色或表皮葡萄球菌δ-溶血素是SAT典型代表。δ-溶血素由26个氨基酸组成、同时有疏水和亲水性α-螺旋结构, 插入细胞膜后可改变表面张力或损伤[17]。葡萄球菌δ-溶血素对脂类物质具有天然的亲和力, 不仅能溶解红细胞, 还能溶解其他哺乳类细胞及其细胞器膜结构[18]。较之细胞膜的有序结构域, 葡萄球菌δ溶血素更优先结合于无序结构域, 低浓度时该溶血素平行吸附于靶细胞膜表面, 导致短暂性膜结构改变、膜张力下降、离子外流甚至触发膜脂质翻转, 高浓度时溶解细胞膜[17-18]。
  
  3 溶血素的致病机制
  
  细菌溶血素不仅可导致细胞膜损伤、细胞活力下降以及细胞溶解或裂解, 还可引起细胞凋亡 (apoptosis) 或细胞坏死性凋亡 (necroptosis) 。此外, 近年发现一些细菌溶血素能引起强烈的炎症反应并导致炎症性损伤[19-20]。
  
  3.1 细胞溶解或裂解
  
  膜成孔溶血素通过在靶细胞膜上形成穿膜蛋白孔道引起细胞渗透性红细胞溶解 (溶血) 以及单核细胞、粒细胞、内皮细胞和上皮细胞裂解。
  
  3.2 细胞膜损伤和细胞活力下降
  
  酯酶类溶血素水解靶细胞膜脂质双层中的磷脂, 表面活性类溶血素插入靶细胞膜后引起膜表面张力和渗透压改变, 轻者导致细胞活力下降, 重者导致溶血或有核细胞裂解。
  
  3.3 膜损伤相关离子失衡与病变
  
  溶血素引起的细胞膜损伤可使膜两侧离子从高浓度一侧向低浓度一侧流动, 通常Ca和Na从胞外流入胞内, K从胞内流出胞外。
  
  3.3.1 Ca浓度失衡与病变
  
  胞内游离Ca水平升高可激活Ca依赖蛋白酶类以及胞内信号传导系统, 如钙调蛋白 (Ca M) 、钙依赖核酸内切酶、钙依赖磷脂酶A2 (PLA2) 信号传导通路。金黄色葡萄球菌α-溶血素和肺炎球菌PLY膜孔道可使Ca内流, 激活钙依赖核酸内切酶和酪氨酸磷酸酶 (PTPase) , 引起IL-2等细胞因子释放和膜结构异常;大肠埃希菌Hly A膜孔道进入的Ca可激活PLA2信号通路, 产生花生四烯酸、前列腺素、前列环素和白三烯, 引起组织和器官功能紊乱、血管渗透性增加和脂质性炎症反应[21-23]。
  
  3.3.2 K浓度失衡与病变
  
  金黄色葡萄球菌α-溶血素膜孔道使K外流, 气道上皮细胞去极化并激活p38MAPK信号通路, 导致细胞活力下降并引起炎症反应和气道重塑, K损耗还引起单核细胞白细胞介素转换酶 (Interleukin converting enzyme, ICE) 的激活, 促进成熟IL-1β释放;T淋巴细胞K泄漏可导致细胞凋亡[23]。
  
  3.4 细胞凋亡
  
  坏死 (necrosis) 是细胞所有大分子物质的降解, 主要依赖于溶酶体破裂后释放的酶类[22]。凋亡是细胞程序性死亡, 为DNA在内源性核酸内切酶作用下被裂解。根据作用机制不同, 细胞凋亡可分为caspase依赖和caspase非依赖两条途径[25]。
  
  3.4.1 caspase依赖细胞凋亡
  
  主要有膜死亡受体/配体Fas/Fas L-caspase-8/3途径和线粒体相关Cyt C-caspase-9/3途径[26]。创伤弧菌细胞溶素 (Vibrio vulnificus cytolysin, VVC) 可入胞作用于线粒体引起膜损伤, 导致细胞色素C (Cyt C) 释放, 通过Cyt C-caspase-9/3途径引起血管内皮细胞、肺上皮细胞和肝细胞凋亡[27]。创伤弧菌VVC还能与靶细胞膜胆固醇结合, 激活Fas/Fas L-caspase-8/3途径诱导内皮细胞和上皮细胞凋亡[28]。肠出血性大肠埃希菌溶血素 (Enterohemorrhagic Escherichia coli hemolysin) 以外膜囊泡方式入胞并靶向线粒体, 经Cyt C-caspase-9/3途径引起内皮细胞和上皮细胞凋亡[29]。金黄色葡萄球菌β-溶血素具有SMse活性, 水解靶鞘磷脂产生神经酰胺, 通过CER-caspase-3途径引起细胞凋亡[16,30]。
  
  3.4.2 caspase非依赖细胞凋亡
  
  近年发现巨噬细胞吞噬病原微生物过程中产生的高水平活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS) 可通过p53激活Bcl-2家族Puma和Noxa, 抑制抗凋亡Bcl-2并使促凋亡Bax去抑制, 使线粒体释放凋亡诱导因子 (apoptosis-inducing factor, AIF) 和核酸内切酶G (endonuclease G, Endo G) , 引发caspase非依赖细胞凋亡[31]。金黄色葡萄球菌α-溶血素可引起使单核细胞ROS介导caspase非依赖细胞凋亡[32,33]。
  
  3.5 细胞坏死性凋亡
  
  细菌感染宿主后产生的肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 可激活炎症相关细胞程序性死亡[34], 称为坏死性凋亡, 其关键环节是蛋白激酶RIPK-1/-3激活, 但上下游信号通路尚不清楚[35]。一些细菌PFT可引起肺组织细胞坏死性凋亡, 其主要机制是离子外流和氧化暴发 (oxidation burst) 激活RIPK-1/-3所致[36]。
  
  3.6 炎症反应
  
  病原微生物感染后机体通常产生炎症反应, 可引起组织或细胞炎症性损伤或死亡。近年发现, 不少细菌溶血素可通过Toll样受体 (Toll-like receptors, TLRs) 和Nod样受体 (Nod-like receptors, NLRs) 引发强烈的炎症反应。迄今所知哺乳类细胞有4种模式识别受体:TLRs、NLRs、凝集素样受体 (CLRs) 和解旋酶样受体 (RLRs) , 其中TLRs和NLRs识别病原微生物及其组分并介导感染性炎症反应[37]。
  
  3.6.1 TLRs介导的炎症反应
  
  与配体结合后经My D88或TRIF途径激活NF-κB、p38MAPK和JNK信号通路上调多种致炎细胞因子表达。近年发现, TLR2识别霍乱弧菌溶血素, TLR4识别产气荚膜梭菌PFO、链球菌SLO和炭疽杆菌炭疽溶素O (anthrolysin O, ALO) , TLR2和TLR4识别肺炎链球菌PLY、李斯特菌LLO和问号钩端螺旋体溶血素, 通过上述信号通路上调多种致炎细胞因子表达[38-40]。问号钩端螺旋体溶血素Sph2、Hlp A和Tly A诱生IL-1β或TNF-α的活性甚至与大肠埃希菌LPS相当[40]。此外, 溶血后释放的亚铁血红素可被TLR4识别, 激活上述信号通路引发炎症反应[41]。此外, 金黄色葡萄球菌α-溶血素经NF-κB信号通路促进巨噬细胞表达IL-8, 引起中性粒细胞浸润为主的化脓性炎症[42]。
  
  3.6.2 NLRs介导的炎症反应
  
  NLRs位于胞浆, 分为NLRP1~NLRP5, 其中NLRP3可与接头蛋白ASC和半胱天冬蛋白酶-1 (caspase-1) 组成炎症小体 (inflammasome) [43]。NLRP3炎症小体调控IL-1β、IL-18、IL-33和高迁移率族蛋白-1 (High mobility group box 1, HMGB-1) 表达, IL-1β和HMGB-1可经自分泌和旁分泌途径分别与IL-1β受体 (IL-1βR) 和TLR2/4结合, 激活NF-κB、p38MAPK和JNK信号通路放大炎症反应[43-45]。NLRP3炎症小体激活机制如下: (1) ROS途径:激活能力最强, 细胞吞噬病原体时细胞骨架重排、细胞膜损伤激活的NADP/NADPH氧化酶系统以及线粒体膜损伤所致电子漏均可产生大量ROS; (2) 溶酶体途径:吞噬泡与溶酶体融合或溶酶体膜损伤时均可释放组织蛋白酶B (cathepsin B) 激活NLRP3炎症小体; (3) 半通道途径:P2X7离子通道激活后释放的ATP等可诱导跨膜缝隙连接蛋白-1 (pannexin-1, Panx1) 六聚体开放孔道, 亚铁血红素等NLRP3配体分子经该孔道入胞激活NLRP3炎症小体[43-44]。细菌溶血素所致膜损伤引起ROS升高和组织蛋白酶B释放、溶血产生的亚铁血红素, 均可激活NLRP3炎症小体[44,46]。金黄色葡萄球菌α-溶血素可激活NLRP3炎症小体, 导致特征性IL-18和HMGB-1表达和分泌[32-33]。金黄色葡萄球菌α-溶血素和P-V杀白细胞素、肠出血性大肠埃希菌溶血素和李斯特菌溶素LLO虽可经TLR2/4引起炎症反应, 但激活NLRP3炎症小体是引起炎症反应的主要机制[33,47-49]。此外, TLR4-NF-κB信号通路可上调巨噬细胞NLRP3表达[50]。
  
  3.6.3 离子流与炎症相关性
  
  金黄色葡萄球菌α-溶血素和P-V杀白细胞素均引起的靶细胞K外流可促进IL-1β分泌[47,51], 该α-溶血素相关K外流还可激活p38MAP和NF-κB, 上调IL-8合成与分泌[52]。此外, 胞内K减少可导致caspase-1激活, 剪切IL-18前体使之成熟并促使其分泌或激活ICE促进IL-1β外分泌[23,53]。细菌溶血素膜损伤引起的Ca内流可激活PLA2信号通路产生脂质性炎症介质, 另可通过细胞呼吸暴发 (respiratory burst) 和线粒体产生大量ROS激活NLRP3炎症小体[21-23,54]。
  
  4 小结与展望
  
  细菌溶血素可通过细胞膜损伤、细胞溶解或裂解、离子失衡相关病变、细胞凋亡、炎症反应等参与细菌致病过程。然而, 大肠埃希菌α-溶血素、伤寒沙门菌E-溶血素 (Hly E) 和乙型链球菌β-溶血素还能作用血管内皮细胞和血小板, 使毛细血管渗透性增高和凝血障碍而引起出血, 其中伤寒沙门菌还可感受宿主应激性激素释放Hly E[5,55], 但机制不明。近年发现, 细菌LPS经caspase-1激活小鼠caspase-11或人caspase-4/5相关非经典炎症小体 (non-canonical inflammasome) , 剪切gasdermin家族中gasdermin-D成为有活性的gasdermin D-NT, 从细胞膜内侧形成膜孔道, 引起炎症性程序性死亡, 称为细胞焦亡 (pyroptosis) [56-58]。因此, 同样具有激活caspase-1和膜成孔毒性的细菌溶血素能否激活非经典炎症小体并诱导细胞焦亡值得研究。
  

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