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基于离子交换层析分离纯化人结合珠蛋白的研究

作者: amvip
来源: uumtu
日期: 2018-11-19 17:58
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 结合珠蛋白( haptoglobin,Hp) ,又称触珠蛋白,于1938 年由两名法国人Polonovski 和Jayle 首次发现。Hp 是血清α2 球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白,主要由肝脏合成,广泛存在于人类和多种哺乳动物的血清及体液中。Hp 作为急性期反应蛋白,当炎症、感染、创伤、恶性肿瘤等发生时在血液循环中水平会升高4 ~ 6 倍,在参与宿主抗感染、损伤组织的修复以及内环境稳定的过程中起着重要作用。Hp 在人血浆中含量较丰富,正常血浆水平可达0. 3 ~ 2 g /L。人Hp 主要存在3 种表现型,即Hp1-1,Hp2-1,Hp2-2。Hp 基本结构为四聚体,由两条β 链和两条α 链( α1 链或α2 链) 组成,β 链相对分子质量( Mr) 约为40 × 103,α1 链约为9 × 103,α2 链为17 ×103。其中,Hp1-1 由2 条β 链和2 条α1 链组成;Hp2-1 由2 条β 链,1 条α1 链和1 条α2 链组成;Hp2-2 型由2 条β 链和2 条α2 链组成。由于α2链有一个特殊的巯基,可形成二硫键,形成大分子量的聚集体,如单体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体甚至更大的聚集体。所以这些聚集体主要存在于Hp2-1 和Hp2-2 中,而Hp1-1 主要以单体的形式存在。Hp 主要功能是与游离的血红蛋白( hemoglobin,Hb) 结合并促使其从循环系统清除。在慢性贫血、输血反应或烧伤等急性情况下,Hp 能与红细胞溶解释放出的游离Hb 结合,形成复合物,促使游离Hb 被机体清除,避免对肾脏的损伤。此外,Hp 还具有抗氧化、抑制前列腺素合成、?;ひ谎趸?、免疫调节等功能,因此具有重要的医用价值。早在1985 年,日本就批准Hp 浓缩制剂用于临床,主要用于治疗烧伤、烫伤、输血、体外循环心脏直视术等引起的溶血反应伴血红蛋白血症或血红蛋白尿等。Cohn 组分Ⅳ是低温乙醇法生产白蛋白过程中产生的一种副产品,富含许多具有药用价值的蛋白,如白蛋白、转铁蛋白、α1-蛋白酶抑制剂、Hp、抗凝血酶Ⅲ等,但在工业生产中一般被废弃,造成严重的资源浪费。本研究以血浆蛋白生产过程中的Cohn 组分Ⅳ为起始原料,采用利凡诺与硫酸铵沉淀组合的前处理方法,后续又采用离子交换层析的方法成功分离纯化Hp,为进一步建立简单易行的Hp生产工艺奠定基础,有助于提高Cohn 组分Ⅳ的综合利用率。
  1 材料与方法
  1. 1 材料
  Cohn 组分Ⅳ溶解液( 华兰生物工程股份有限公司惠赠) ; 人血红蛋白( 实验室制备) ; 离心机( Heraeus 公司,型号: Biofuge Prime R) ; 超滤系统( 北京旭邦膜设备有限责任公司,型号: UF-30K) ; QSepharose Fast Flow、蛋白纯化仪( 型号: AKTA purifier100) 、凝胶成像仪( 型号ImageQuant 350) ( 均GE 公司) ; 层析柱( 25 mm × 40 cm,上??祷瞧髦圃旃? ; 垂直电泳仪( Bio-Rad 公司,型号: mini-PROTEAN Tetra) 、转印仪( 北京六一生物科技有限公司,型号: 40D) 、水浴锅( Pharmacia Biotech 公司,型号: MultiTemp Ⅲ) 、兔抗-Hp 抗体( 博士德生物公司) 、HRP 标记的山羊抗兔二抗( 中杉金桥) ,BCA蛋白含量检测试剂盒( 鼎国昌盛生物技术公司) ,其他试剂均为国外或国产分析纯。
  1. 2 Cohn 组分Ⅳ前处理
  将Cohn 组分Ⅳ溶解液200 ml 用醋酸铵溶液( 0. 05 mol /L pH 8. 5) 600 ml 稀释至蛋白浓度约为50 mg /ml( BCA 法测定) ,调pH 为8. 5,然后加入2%利凡诺至终浓度8 mg /ml( 约532 ml) ,室温搅拌20 min,4 ℃静置2 h,弃沉淀,收集上清。加入活性炭吸附,并用滤板过滤,收集滤液调pH 为7. 0。加入硫酸铵至50% 饱和度( 约344 g) ,室温搅拌20 min,4 ℃ 静置30 min。然后4℃,8500 × g 离心30 min。取沉淀并溶于500 ml NaAc-HAc( 0. 05 mol /LpH 5. 5) 缓冲液中,进行超滤脱盐( 截留相对分子质量为30 × 103 ) ,即为前处理样品。
  1. 3 Q Sepharose Fast Flow 层析
  用HAc-NaAc 缓冲液( 0. 005 mol /L pH 5. 5) 平衡Q Sepharose Fast Flow 层析柱( 6. 0 cm × 2. 5 cmI. D,CV = 30 ml) ,流速为10 ml /min。将前处理样品用NaAc-HAc 平衡液10 倍稀释( 约3. 5 mg /ml,共300 ml) 后进行上样,流速10 ml /min。待上样结束后用平衡液继续流洗,去除与层析柱未结合或结合不紧密的蛋白,然后分别用含0. 025、0. 05、0. 1、0. 2 mol /L NaCl 溶液进行分步洗脱,层析过程均以280 nm 紫外波长进行监测,收集各个峰值范围的洗脱液,并进行鉴定分析。
  1. 4 SDS-PAGE 分析
  将各峰值范围洗脱蛋白进行SDS-PAGE 电泳分析。分别采用非还原性SDS-PAGE( 5% 浓缩胶、8%分离胶) 与还原性SDS-PAGE( 5% 浓缩胶、12%分离胶) 的方法进行蛋白分离,初始电压80 V,待指示剂进入分离胶,电压调至120 V。电泳完毕,用考马斯亮蓝染色法并进行分析。
  1. 5 免疫印迹鉴定
  将0. 1、0. 2 mol /L NaCl 洗脱产物进行免疫印迹分析。先进行SDS-PAGE( 5% 浓缩胶、8% 分离胶) ,后利用湿转膜仪将凝胶上蛋白样品转移至PVDF 膜上,恒流300 mA。用5% 脱脂奶粉室温封闭40 min,后用Hp 抗体室温孵育2 h( 稀释比例为1∶ 400) 。TBST 洗膜3 次,5 min /次; 加入羊抗兔二抗( 稀释比例为1∶ 5000) 室温孵育1 h。TBST 洗膜3次,5min /次; 加入显影AB 液,暗室显影。
  1. 6 Hp 活性测定
  Hp 与Hb 结合形成复合物后相对分子质量发生变化,在进行电泳时,游离Hb 电泳迁移速度快,二者结合所形成的Hp-Hb 复合物迁移速度慢。另外,Hp-Hb 能增强或?;b 的过氧化物酶活性,基于Hb 过氧化物酶活性利用特殊染色方法,Hp-Hb复合物与游离的Hb 均能发生显色,且可被明显区分,而未添加Hb 的Hp 对照则不能显色?;谏鲜隽降?,本文建立了测定Hp Hb 结合活性的方法。将纯化所得Hp 样品即0. 1、0. 2 mol /L NaCl 洗脱蛋白混合并浓缩,经BCA 法测定蛋白含量后,用生理盐水稀释,使终浓度分别为1 ~ 10 mg /ml,Hb稀释至2 mg /ml,各取100 μl 混合后37℃ 温育30 min,利用Native-PAGE 进行活性测定。采用5%浓缩胶、7% 分离胶,180 V 恒压进行电泳,并维持低温冰浴进行4 h。电泳完毕,用大联茴香胺进行染色,从不能检出游离Hb 的最低样本量计算出样品中Hp 的Hb 结合能力。
  2 结果
  2. 1 Cohn 组分Ⅳ前处理效果
  Cohn 组分Ⅳ经利凡诺及硫酸铵两步前处理后,与原液相比,该前处理方法有效减少、去除部分小分子杂蛋白,如白蛋白等,并使目的蛋白富集
  2. 2 Q Sepharose Fast Flow 层析
  Cohn 组分Ⅳ预处理液经Q Sepharose Fast Flow介质在pH 5. 5 条件下吸附后,用不同浓度NaCl 溶液洗脱共获得5 个峰
  2. 3 SDS-PAGE 鉴定
  Hp 基本结构为四聚体,在进行还原性SDSPAGE时会裂解成约45 × 103、20 × 103 或14 × 103的蛋白,因此,可通过比较还原性与非还原性SDSPAGE结果初步确定Hp。将各盐浓度洗脱蛋白进行SDS-PAGE 电泳,结果发现0. 025 和0. 05 mol /LNaCl 洗脱进一步去除了小分子杂蛋白,如转铁蛋白。而在0. 1 和0. 2 mol /L NaCl 洗脱过程中,则获得一系列较大相对分子质量的Hp 多聚体 。并且由还原性电泳结果可知,Hp 多聚体能裂解为约45 × 103 和20 × 103的蛋白,与理论值接近,进一步证明这一系列多聚体为目的蛋白Hp。
  2. 4 免疫印迹分析
  免疫印迹分析结果表明,245 × 103 附近的一系列多聚体条带为目的蛋白Hp,即进一步确定0. 1、0. 2 mol /L NaCl 洗脱产物确为目的蛋白Hp。
  2. 5 Hp 活性测定
  Native-PAGE 染色后结果表明单独的Hp 并不能显色 ,而通过与Hb 结合增强或?;b 过氧化物酶活性而发生显色反应( 图5A 中Hp-Hb 复合物) 。通过Native-PAGE 方法测得Hp在10 ~ 7 mg /ml 时,未检测到游离的Hb 条带,表明在此范围Hp 与Hb 完全结合。由此1 7 5 军事医学 2016 年7 月 第40 卷 第7 期 Mil Med Sci,Vol 40,No 7,Jul,2016可知Hp 完全结合Hb 的最低浓度约为7 mg /ml。本文参照日本Benesis 公司对Hp 活性定义方法,定义1 U Hp 意义为: 结合1 mg Hb 所需Hp 的量,据此可推算本次实验中结合1 mg Hb 约需要3. 5 mg Hp ( 结合1 mg Hb 所需的Hp =未检测到游离Hb 的最低Hp 浓度Hb 稀释浓度= 72) ,即本次活性测定实验中3. 5 mg Hp 为1 U,由于纯化所得Hp为10 mg /ml,因此可知其活性约为2. 8 U/ml ( 10mg /ml) 。
  3 讨论
  人血浆Cohn 组分Ⅳ富含多种蛋白,其中白蛋白最为丰富,约残留有总血浆10% 的白蛋白,因此,分离纯化人Hp,白蛋白为最主要的杂质,需首先去除。本研究采用利凡诺与硫酸铵沉淀组合的前处理方法,不仅操作方法简单,且能有效去除白蛋白等杂蛋白,经过摸索发现当利凡诺浓度为8 mg /ml 时,去除小分子量杂蛋白效果最佳,还能使目的蛋白富集,为一种简单、有效的前处理方法,适用于规?;那按砉?。
  离子交换层析分离生物大分子,主要是基于其表面的电荷特性?;贑ohn 组分Ⅳ中主要蛋白等电点的差异性,致使蛋白对介质的亲和性不同,通过改变洗脱液的离子强度和pH,可分离纯化得到目的蛋白。Cohn 组分Ⅳ中蛋白等电点多为4 ~ 6,本研究经过探索发现当在pH 5. 5 时,血浆蛋白电荷差异性能实现对目的蛋白的有效分离。研究前期发现当pH 为4. 6 时,虽也能实现目的蛋白的有效分离,但Hp 活性较低,这一发现与日本相关研究一致,Hp 的稳定pH 值范围5. 0 ~ 10. 5,pH < 4. 5 产生不溶物,pH > 11. 0 血红蛋白结合能力均显著低下。此外,目前虽有采用亲和的方式分离纯化Hp,如通过Hb、抗体、刀豆蛋白A 分离纯化Hp,但此种方式洗脱条件多较为严苛,易造成活性损失,且有配基脱落的危险,成本较高,不利于进行规?;票?。本研究所采用的Q Sepharose Fast Flow 离子交换介质,具有高化学稳定性、高流速、高载量、操作简单易行,且相比亲和纯化方法成本较低,利于大规模生产。人Hp 主要存在3 种亚型,即Hp1-1,Hp2-1,Hp2-2。非还原性SDS-PAGE 电泳可清晰显示Hp二聚体、三聚体、多聚体条带,在( 100 ~ 600) × 103范围内呈阶梯状分布?;乖許DS-PAGE 电泳则仅能显示β、α1、α2 条带。从本文还原性SDS-PAGE结果分析可知,从Cohn 组分Ⅳ中分离纯化得到的主要为Hp2-2,与文献研究结果一致。本研究建立的络合- 盐析- 离子交换的Hp 纯化方法具有方法简单、稳定性较好、成本较低等优点,适于人Hp 的规?;票?。保障工作与现有飞行员医学保障区别较大,操纵员的认知能力、空间感知能力等研究将成为热点。
  4 结语
  为探索美海军航空医学研究发展现状,本文以美NAMRL 发表的文献为研究对象,利用TDA 软件对研究时间、研究领域、文献来源等情况进行分析。结果表明,TDA 软件在对不规范信息的处理分析中,可靠性和便捷性较高,数据清洗的方式比较便捷。NAMRL 作为美军专门从事海军航空医学研究的机构,研究成果丰硕,年度科研成果产出数量不规律,作者人均发文量不高,合著规模不大,发文去向以内部资料和科技期刊为主。研究内容集中在航空选拔、生理效应、认知能力、视觉功能、生理训练与标准、辐射防护等方面,航空医学特色明显。分析结果对了解把握美海军航空医学研究内容和发展状况具有较大的参考价值。下一步,我们将利用这些线索扩大相关文献获取,构建专题数据库来深度分析利用相关资料。
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