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基于非编码RNA在药理学研究中的应用

作者: amvip
来源: uumtu
日期: 2018-11-19 17:58
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 哺乳动物基因组编码蛋白质及翻译调控序列在基因组中所占比例不足3%,但庞大的基因组中至少有75%可被转录。提示人类基因组序列保留下来的非编码区远大于编码区。以往学者认为,生物的奥秘存在于编码区。但近年的研究表明,低等生物与高等生物编码蛋白质的基因差别并不大,且越高等生物其非编码区所占的比例越高。由此表明,高等生物进化的高度复杂性可能蕴藏在这些看似余杂物的非编码区。
  非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)是对一类能转录但不编码蛋白质且具有特定功能的RNA 小分子的统称。其种类繁多,以至于产生了“RNA世界”的概念。除转运RNA和核糖体RNA外,还包括核小RNA、核仁小RNA、核糖核酸酶P-RNA、端粒酶RNA、微RNA(microRNA,miRNA)和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)等。依据长度,ncRNA 分为短链ncRNA 和长链ncRNA(lncRNA)。短链ncRNA一般指长度<200 nt的ncRNA,如miRNA,siRNA,Piwi 作用RNA(Piwi- interacting RNA,piRNA)和核仁小RNA等。长链ncRNA 指长度>200 nt 的ncRNA,称为lncRNA。ncRNA 主要参与转录调控、RNA 剪切修饰、信使RNA(messenger RNA,mRNA)的稳定和翻译、蛋白质的稳定及转运、染色体的形成及结构稳定等。
  1 miRNA 家族
  miRNA 是内源性的小非编码RNA,约22 个核苷酸,可与位于mRNA 3’-UTR 的互补区结合,再与RNA 诱导沉默复合体结合,调控靶基因的表达。miRNA 家族对于生理病理的调控至关重要,可调控至少半数的转录组,并参与协调许多常规蛋白质介导的反应。随着miRNA 生物信息学及网络数据库的迅猛发展,其发现速度明显提升。目前已经公布了包括140 个物种的15 000 个miRNA 基因座,及17 000 个成熟的miRNA 序列。许多miRNA 都是组织特异性及发育阶段特异性表达的。miRNA 主要通过调控信使RNA 的翻译而发挥作用。一个miRNA 可调控多个信使RNA,而一个信使RNA 上又可有多个miRNA 的调控位点。一系列相关的miRNA 可能在不同的水平影响一整套通路,从而形成复杂的miRNA- mRNA 调控网络。近年来,miRNA 在药理学和药物开发等方面的研究主要集中在以下几个方面。
  1.1 生物标志物
  许多miRNA 的表达具有组织特异性及发育阶段特异性。将miRNA 表达特性与疾病的特异性亚型、不同的发展阶段以及不同的恶化程度相关联,使其成为极具潜力的诊断标志物、治疗靶位及预后标志物。这在癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等方面尤为重要。研究发现,在结直肠癌的不同发展阶段存在多种miRNA 表达的特异性改变,如在肿瘤发生期miR-17,miR-143,miR-34,miR-101 和miR-124 表达降低;肿瘤生长和存活期miR-145,miR-34和miR-126表达降低,miR-21表达增加;血管生成期miR-126 表达降低;肿瘤转移期miR-200c,miR-141 和miR-34 表达降低,miR-21 表达增加。以此形成了疾病发生发展的特异性miRNA 表达谱,进而根据特异的miRNA 表达可以确定不同的疾病进程。此外研究还发现,结直肠癌患者血清中miR-21 的水平与复发和死亡有关,提示miR-21 不能成为临床上很好的肿瘤预后标志物。在1 项慢性粒细胞白血病9 号染色体9q34.1 缺失患者对伊马替尼抗性的临床试验中,15 例(44.11%)患者表现出对伊马替尼的抗性,而miR-199b 在这些伊马替尼抗性患者中表达明显降低,提示其可能成为预后及药物治疗效果的重要标志物。
  1.2 作用靶标
  miRNA 主要通过对mRNA 的转录后调控发挥作用。研究表明,人类编码基因中60%以上在其3’- UTR 区都存在miRNA 调控位点。据此推测miRNA 在生理和病理中的作用举足轻重。已知miR-107 直接靶向抑制β-淀粉蛋白剪切酶(β-amyloid cleavage enzyme,BACE1)的表达,而miR-107 在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)早期表达下调,加速了AD 的发生发展。提示miR-107一方面可以作为AD 早期诊断的标志物,另一方面可以作为药物干预的靶标,如在AD 早期患者中选择性过表达miR-107 或其拟似物或可改善病情。miR-122 在肝中表达,其与丙肝病毒的复制、稳定性传播、胆固醇调节和脂代谢均密切相关。Mira?virsen(SPC3649)为靶向miR-122 的特异性抑制剂,该药物目前已进入丙肝病毒治疗的Ⅱ期临床研究阶段。除miRNA 自身外,miRNA 的目标分子及参与其成熟的作用因子都已成为药物基因组学中寻求的靶标,以期实现疾病的个性化治疗。此外,针对复杂的miRNA-mRNA 调控网络展开特异性的表达干预也可能产生多靶点效应。
  1.3 对药物代谢酶、转运蛋白和核受体等编码基因的影响
  许多基因药理学的研究主要集中于药理相关基因的外显子、内含子和启动子区的变化等方面。这些基因包括编码药物代谢酶、转运蛋白和核受体等蛋白的基因。研究表明,miR-27b 可直接调控细胞色素酶(cytochrome P450,CYP)3A4 的表达,而miR-148 则可通过调控孕烷受体间接调控CYP3A4的表达;硫酸基转移酶1A1 可直接被miR-631 调控。由此提示,一些特异性miRNA 表达的改变可影响机体对药物的反应,产生药物治疗效果的差异,使机体应对药物治疗的个体差异及对药物(如抗癌药物)耐药性的改变等有了更为合理的解释。据此,可以通过抗药细胞模型筛选使机体对药物产生抗性的特异性miRNA,进而通过对此类miRNA进行干扰,研制出针对特异性肿瘤提高抗癌药物效能的新型治疗药物。
  1.4 对学习记忆可塑性和药物成瘾的影响
  神经可塑性与学习记忆能力密切相关。研究发现,miR-132 可激活Rho 蛋白,促进树突棘的生长及未成熟神经元树突的成熟。而miR-138 可抑制乙酰蛋白硫酯酶,负调树突棘的形成。miR-34c和miR-134可抑制脱乙酰酶sirtuin1(SIRT1)和脑源性神经生长因子的表达,降低学习记忆能力。长期使用药物导致脑内相关核团(额前皮质、伏隔核、杏仁核及腹侧被盖区等)神经元及神经元突触可塑性发生明显地变化。而研究发现,miRNA 在伏隔核调控众多与药物成瘾相关基因如脑源性神经神经生长因子、甲基CpG 结合蛋白2 及环磷腺苷效应元件结合蛋白等的表达。研究发现,成瘾后表达上调的miRNA 报道最多的为miR-124a,miR-18a,miR-181a,miR-27b,miR-324-3p 及miR-451 等,并发现不同药物成瘾具有miRNA 表达特异性。采用慢病毒介导神经元高表达miR-124 和Let-7d后,可增加多巴胺转运体(dopamine transporter,DAT)蛋白表达,减少可卡因的条件性位置偏爱。相反,慢病毒介导神经元高表达miR-181a 可降低DAT 蛋白表达,增强对可卡因条件性位置偏爱的影响。大鼠可卡因长时程自身给药后其背侧纹状体中高表达或低表达miR-212 可分别增强或减少自身给药行为,提示miR-212 可促使可卡因成瘾。此外,研究还表明,前额皮质miR-206 表达增加,能够增强大鼠乙醇的摄入量和奖赏效应。而小鼠长期注射尼古丁后,在其海马、额前皮质、边缘前脑和中脑等成瘾相关脑区也发现多种miRNA 的表达增加。对其调控的靶基因进行生物信息学预测,可能为研究尼古丁成瘾的遗传易感性提供新的思路及靶位。
  1.5 表观遗传学调控
  表观遗传调控虽不引起DNA 序列的改变,但在许多生理、病理条件下及药物给予等情况下对基因表达调控起重要作用。例如,长期给予精神兴奋剂可使大脑奖赏途径在表观遗传调控的组蛋白修饰、DNA 甲基化及ncRNA 调节均发生改变[14]。ncRNA的调节为表观遗传机制的重要组成部分。研究表明,组蛋白去乙?;?(histone deacetylase 4,HDAC4)/Sp1/miR- 200a 调控网络可导致miR-200a 表达降低、HDAC4 表达增加及异常的组蛋白乙?;?。过表达miR-200a 可修复肝癌中异常的组蛋白乙?;?,逆转肝癌细胞的恶性表型,抑制肝癌细胞转移,表明HDAC4/Sp1/miR-200a 调控网络可作为肝癌治疗的潜在靶点。
  1.6 miRNA 临床药物转化面临的挑战
  虽然研究表明miRNA 拥有广阔的应用前景,但目前研究还主要集中于实验室开展的生物功能的测定层面,而实现临床药物的转化依然面临严峻的挑战。①随着miRNA 剂量增加,脱靶现象加重;②miRNA 在机体易被降解,目前多通过化学修饰来增加其结合亲和力、核酸酶耐受力以及细胞的吸收能力;③缺乏有效的转运系统以突破机体屏障,难以达到特异性的作用部位;④缺乏可靠的临床前研究模型来评估其效能等。此外,任何事物都有其双面性。由于miRNA 参与形成复杂的miRNA-mRNA 网络,故产生多靶点效应的同时,也可能由于对单个miRNA 干预产生较为广泛的效应,加之上述提到的脱靶现象,很可能对正常组织的其他生理功能产生影响。因此,miRNA 的治疗必须配备合适的靶向机制,如特异的转运系统或是局部注射。
  2 lncRNA
  lncRNA 是长度>200 nt,不编码蛋白的转录本。有些lncRNA 在蛋白编码基因上游启动子区起始转录,干扰下游基因的表达。大多lncRNA 可通过作为支架,与DNA、RNA 以及蛋白质形成二元或三元复合物发挥生物功能。lncRNA 可通过顺式或反式作用调控转录、转录后RNA 编辑、翻译、DNA甲基化以及染色质重构等,其作用方式如下:①与蛋白质相互作用调控蛋白质活性或改变蛋白质定位;②与染色质相互作用诱导染色质重构及组蛋白修饰,实现表观遗传调控;③与mRNA特定位点互补,调控剪切和翻译;④与Dicer 酶作用,产生内源性的siRNA,调控mRNA 降解;⑤与miRNAs 作用阻断其功能,以实现转录后调控。lncRNA 的表达主要通过基因芯片及RNA 测序技术(RNA-Seq)检测,由于lncRNA 研究起步较miRNA晚,其在药理方面的应用仍主要处于药物靶标及生物标志物的探索层面。
  2.1 药物靶标和生物标志物
  lncRNA 生物学功能广泛,其表达具有组织特异性和时空特异性。lncRNA 大量分布于中枢神经系统,推测可能由于脑的高度复杂性,维持脑的正常发育及神经功能需要更多数量的调节型RNA 来调节。研究发现,在老年动物及中枢神经系统紊乱患者的神经系统中,lncRNA 出现异常表达。Sox2OT 是包含有Sox2 基因的lncRNA,二者转录方向一致,其在胚胎干细胞及胚胎细胞分化时期的表达受动态调控。Arisi 等通过生物信息学的分析发现,其有可能成为神经退行性病变的生物标志物。
  BACE1-AS 是由BACE1 基因的反义链转录而来的lncRNA,其高表达于AD 患者的脑内。研究发现,在Aβ1-42等细胞外界刺激作用下,BACE1-AS 表达明显升高。BACE1-AS 通过占据miR-485-5p在BACE1 mRNA 上的结合位点,干扰miR-485-5p对BACE1 mRNA 的抑制作用,进而增加BACE1 mRNA 的稳定性,产生更多Aβ,使AD 患者脑内老年斑增多,加重病情的进展。研究报道,与帕金森病密切相关的SNPrs356219 定位于转录因子YY1(Yin Yang 1)的结合位点,调控位于α-突触核蛋白基因SNCA 3’-UTR 的反义lncRNA RP11- 115D19.1 的表达,而RP11-115D19.1 可负调SNCA 表达。Johnson 等通过对亨廷顿舞蹈症(Huntingtondisease,HD)患者脑组织表达谱的研究,发现RE1沉默转录因子通过特异的DNA 调控元件定位于lncRNA 人类加速区1(human accelerated region 1,HAR1)的基因座,抑制HAR1 转录,使HAR1 在纹状体中表达明显降低,加重病理损伤。lncRNA NEAT1_2(nuclear- enriched abun?dant transcript 1_2)是细胞核亚结构旁斑(para?speckles)的重要组成成分。临床数据显示,NEAT1_2 在正常人运动神经元中几乎不表达,而在肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral scle?rosis,ALS)早期患者的运动神经元中高表达,提示其可能作为ALS 检测的标志物。此外,NEAT1_2在细胞核中作为RNA 与骨架多型性蛋白的骨架,调控FUS/TLS(fused in sarcoma/translated in lipo?sarcoma)及TDP43(TAR DNA- binding domainprotein 43)的功能,参与了ALS 的病理进程。Cd247 基因编码对T 淋巴细胞表面的TCR/CD3 复合物表达及组装起重要作用的跨膜蛋白。下调Cd247 导致系统自身免疫功能障碍,且与NOD 鼠的1 型糖尿病有关。有研究发现,与1 型糖尿病密切相关的23 个SNP 中,有17 个包含在Cd247 第1 个内含子区来源的lncRNA 中。
  2.2 药物成瘾
  对大鼠可卡因条件性位置偏爱模型进行芯片检测,发现764 个mRNA 及603 个lncRNA 表达异常,并发现48 个匹配的mRNA-lncRNA 靶对,表明可卡因诱导伏隔核mRNA 的表达改变与lncRNA 有密切关系,且可能与可卡因引起的神经可塑性及复吸相关。Michelhaugh 等在海洛因成瘾患者相关脑区检测到23 个lncRNA 表达的改变,其伏隔核可以检测到MIAT,MEG3,NEAT1 和NEAT2 的表达增加。对酒精成瘾者尸检发现,MALAT-1 在小脑、海马和脑干中表达增加;生物信息学预测发现,MALAT-1 可能通过调控神经蛋白1(neuroligin 1)及丝氨酸/精氨酸蛋白调控酒精戒断症状。
  2.3 耐药性调控
  表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epider?mal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibi?tors,EGFR-TKI)被批准用于治疗复发性非小细胞肺癌(non- small cell lung cancer,NSCLC)患者。EGFR- TKI 治疗NSCLC 受天然及获得免疫的调控。研究报道,lncRNA 生长停滞特异性转录因子5(growth arrest-specific transcript 5,GAS5)可能与EGFR-TKI 抗性有关,GAS5 在肺癌组织中的表达与癌旁相比明显降低,EGFR-TKI 敏感的细胞系中GAS5 的表达明显高于抗性细胞,在人肺腺癌细胞A549 中高表达GAS5 能够逆转EGFR 通路及胰岛素样生长因子1 受体(insulin-like growth factor 1receptor,IGF-1R)蛋白的表达,促进肿瘤细胞的死亡。此外也有研究表明,lncRNA AK126698 通过靶向NSCLC 耐药细胞中高表达的Wnt/β-链蛋白信号通路受体FZD8,有效降低NSCLC 细胞对顺铂的耐药性。
  舒尼替尼(Sunitinib)药物抵抗是目前晚期肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)治疗的主要问题。王红阳课题组研究发现,舒尼替尼的临床治疗效果与lncARSR(lncRNA activated in RCC withsunitinib resistance)有关。lncARSR 一方面通过结合miR- 34/miR- 449,促进AXL 及c- MET 在RCC 细胞中表达,发挥舒尼替尼抵抗作用。另一方面,具有生物活性的lncARSR 能够整合到外泌体,被运送到舒尼替尼敏感细胞,使其脱敏,起到传递舒尼替尼抗性的作用。对舒尼替尼抗性的RCC 用靶向lncARSR 的锁核酸(locked nucleic acids)或AXL/c-MET 抑制剂处理后可恢复舒尼替尼抗性,表明lncARSR 为舒尼替尼抗性治疗的潜在靶点。
  2.4 表观遗传学调控
  在lncRNA 的研究中也发现,lncRNA 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 反义转录1(glypican 3 antisensetranscript 1,GPC3-AS1)通过表观调控GPC3,增加GPC3 表达,促进肝癌细胞的增殖和迁移。2.5 lncRNA 临床应用及局限lncRNA 存在于体液中且与疾病的病理密切相关表明其为临床理想的诊断候选物,尤其是病理位点难以进入的神经退行性疾病等。已有研究报道,前列腺癌特异性高表达的lncRNA 前列腺癌抗原3(prostate cancer antigen 3,PCA3),可用于前列腺癌症的临床诊断,提示lncRNA 具有作为生物标志物用于疾病的诊断和预后的可能性。此外,治疗性靶向lncRNA 的研究也受到了越来越多的关注。针对有益的lncRNA,可利用其表达的时空特异性,辅助治疗药物对靶器官的特异性投递。如Mizrahi 等根据lncRNA H19 在卵巢癌高表达的特性,在载体上将白喉毒素的表达序列置于H19 启动子下游,导入机体后可使卵巢癌组织特异性地高表达白喉毒素,在提高疗效的同时降低对机体正常组织的损伤。而针对有害的lncRNA,主要采用以下方式阻断其功能:①利用RNAi 沉默lncRNA;②利用反义核苷酸封闭lncRNA 活性;③ 利用RNA 酶诱导lncRNA 降解;④利用小分子抑制剂封闭lncRNA 与相互作用蛋白的结合位点,阻碍其功能;⑤利用小分子抑制剂结合lncRNA,影响其正确折叠,使其构象发生改变。
  现在对lncRNA 的认识十分局限,严重限制了lncRNA 的临床应用。如现在并不清楚到底是ln?cRNA 的改变导致了疾病的发生,还是疾病的发展导致了lncRNA 的改变。除此之外,lncRNA 的稳定性也有待进一步的考证,疾病发展的不同阶段其稳定性是否相同,如果不同,其调控机制又是怎样的;在基础研究向临床应用的转化中应该采取何种手段才能合理有效地干预lncRNA;外源分子在机体的投递系统如何建立等都待探索。
  3 其他
  除上述2 种主要的ncRNA 外,其他一些ncRNA 研究近年来也相继进入了活跃期。如环形RNA(circular RNA,circRNA)等,虽然目前其机制研究不如上述二者清楚,但是实验表明,它们在疾病的发生发展中也起了重要作用,有可能成为新的研究方向。不同种类的RNA 之间由于竞争或协同构成了相互调控网络,发挥生理、病理作用。研究表明,受转化生长因子β 活化的lncRNA(lncRNAactivatedby transforming growth factor- β,lncRNAATB)可竞争性结合miR-200 家族,上调ZEB1 和ZEB2,诱导上皮-间充质转分化,促进肝癌细胞的侵袭;且lncRNA- ATB 还可结合白细胞介素11mRNA,增加白细胞介素11 mRNA 的稳定性,上调其表达,促进其分泌,从而改变肿瘤微环境,显著促进肿瘤转移。因此,对RNA 网络进行深入研究可以更好地了解人类发育过程及疾病的进程,对药物靶标的确定及药物开发意义重大。
  4 结语
  综上所述,ncRNA 相关的药理学研究发展迅猛,然而目前已知ncRNA 的功能及其药理功效依然知之甚少,尚处于理论阶段,由实验室研究转向临床药物开发是其研究的重点也是难点。尽管如此,对ncRNA 的深入研究无疑将药物研发带入了一个新的更为广阔的领域,了解其特异性的功能可能引导人们进入全新的个性化治疗的新时期。
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